LI-6800测量新技术DAT | 做整条A-Ci曲线，只需要4min

苑玲玲

苑玲玲，博士，2014年毕业于University of Nebraska-Lincoln，专业为Plant Breeding and Genetics。同年，加入LI-COR公司环境部，现为资深应用科学家。

你用400 ppm min^-1来Ramp，就意味着做整条A-Ci曲线（例如从10ppm-1600ppm），只需要4min，这就大大缩短了测量时间【考虑到种内和种间差异，具体Ramp参数设置，请通过预实验确定】。新技术显著缩短了测量耗时，大大提升了测量效率。

新技术和传统方法得到的Vcmax、Jmax和二氧化碳补偿点吻合度高。但是，传统方法测量得到的原始数据点少，曲线拟合出来的参数具有更大的不确定性。除了A-Ci曲线，这项新技术也在调查类测量（Survey Measurement）和光响应曲线测量（A-Q Curve）方面做了验证。

LI-COR 苑玲玲：LI-6800测量新技术DAT.mp3

A new technique for gas exchange measurements: Dynamic Assimilation^TM

2021.10.16 武汉

各位老师同学，大家好！今天给大家介绍一项用于叶片气体交换测量的新技术。

叫做Dynamic Assimilation^TM，或者是叫Dynamic Assimilation^TM Technique。首字母的缩写就是DAT（动态吸收测量技术）。

首先我们简要回顾一下气体交换测量的历史，之后我会给大家介绍目前所使用的测量技术，然后我会重点谈一下DAT。

世界人口的急剧增长使得人们对于粮食和能源的要求不断增大，这就刺激了光合作用的研究。而对于光合作用研究的需求，又推动了相关仪器和测量技术的发展。

回顾历史，100年前，大约是在1920年左右的时候，研究人员通过化学试剂滴定的方法来测量叶片对于CO₂的吸收，作为评估叶片光合能力的指标。核心原理就是利用CO₂与氢氧化钡产生碳酸钡沉淀，然后用酸来滴定中和，通过对比空白组所需酸的量的差别来计算叶片对于CO₂的吸收。

人工搭建的这个设备，大家可以看到这张图，操作起来费时费力，这张图显示了当时所用的设备。图片出自下面这篇paper，引用过来的。这张图显示的就是通过这种滴定方法测得的一天中甘蔗叶片对于CO₂吸收的日变化。

到了上个世纪四五十年代，红外线气体分析仪逐渐发展了起来，人们便开始把这个红外线气体分析仪用在光合测量设备里面。

当时很多设备因为体积庞大、操作繁琐，基本只能在室内使用。但是因为大家对户外测量是很有需求的，所以一些可移动的设备也被研发出来，如像这个Slide右手边这种。

到了上个世纪八十年代、九十年代的时候，LI-COR公司研发的LI-6200、LI-6400相继问世，可以说是拎起来就走，之后更先进的LI-6800问世，那就更方便了，操作直观，自动化控制。

回顾历史，我们可以看到，人们对于光合测量设备的不断追求，为光合研究提供了新工具。

现在市面上的气体交换测量系统，一般都是采用开路式的方法、开放式气路（进行测量）。

所谓开放式气路，顾名思义是指非封闭。气流持续的有进有出。对LI-6800来说，外界的空气进入主机，水汽、CO₂浓度被调适以后，出来，进入分析器。分流，一路不接触叶片直接被测量，叫做Reference，作为对照。另外一路经过叶片，然后被测量，叫做Sample，最后气流排到外界。Anyway，就是说气流有进有出，这是一个开放式气路。那么在叶片所在的这个位置，就是叶室这个地方，具体发生了什么呢？

这个长方形代表整个叶室部分，气流流经叶室，进气流速为u1，进气流中CO₂浓度为c1,水汽浓度为w1，出叶室的CO₂浓度_c2，水汽浓度_w2，这些指标都会被仪器直接测量记录。由于叶片的光合作用吸收CO₂，蒸腾作用释放水汽，这就是所谓的气体交换，使得_c1和_c2之间，_w1和_w2之间存在差值，这个差值用于计算CO₂同化速率和蒸腾速率。

在这个公式里，A代表CO₂同化速率，E代表蒸腾速率，s代表叶面积。基于对这个气流水汽和CO₂浓度的测量，蒸腾速率和CO₂同化速率就用这两个公式计算出来。这里需要注意的一点是，这两个公式是基于“Steady State"，或者说是稳定状态。长久以来，开路式气体交换测量，都是依赖于“Steady State"。

那你可能要问了，什么叫“Steady State"呢？它是指叶室情况稳定，达到一个稳定状态，就是说CO₂，_c1和_c2达到一个恒定值，水汽w1和w2达到一个恒定值，气流_u1和_u2也要达到一个恒定状态。

一旦不稳定，用这个公式计算出来的CO₂同化速率就是不对的了。比如说，当叶室是空的、关闭的，没有叶片的时候，测得的CO₂的同化速率应该是零，对吧。因为没有叶片，不管你的CO₂浓度控制是多少，或者怎样变化，光合值应该都为零，但是市面上光合仪的表现，却不是这样。

大家会经常注意到，如果你改变CO₂浓度，比如像左边这张图，CO₂控制从400ppm到600ppm，您能看到光合值突然有很大的波动，然后再逐渐的回归到零。

这就意味着，在记录数据的时候，你需要等待，需要等待叶室又重新达到一个新的Steady State后，才能记录数据。大家能看到，这两张图中，前30秒的阶段是一个Steady state，大概70s以后，也是一个Steady state，从30s到70s之间，是一个Non-steady state，就是一个非稳定状态。

如果您在Non-steady state阶段记录数据，那您的数据就是不对的。

那有没有一个方法可以实现更快的气体交换测量呢？

几年前，LI-COR联合The University of New Mexico的研究人员，推出了一项新技术叫做RACiR^TM，RACiR^TM用于CO₂响应曲线的测量。它是通过Ramp CO₂浓度（连续降低或升高CO₂的浓度），像左边这张图，之后通过空叶室校正来得到最终的数据。RACiR^TM让使用者可以更快的测量A-Ci曲线，进而得到Vcmax等参数，这让快速筛选成为可能。

另外由于CO₂是连续变化的，仪器在连续的快速记录数据，因此能获得大量的数据点。大量的数据点，对于A-Ci曲线的拟合是大有帮助的。但RACiR^TM是有局限性的，只能用于A-Ci曲线的测量，不能用于其他类型的测量，如调查式测量（Survey Measurement）或光响应曲线的测量（A-Q Curve）。

另外RACiR^TM所用的这个CO₂ Ramp Rate，不能太快，局限于100ppm/min。另外RACiR^TM需要空叶室校正过程。测量数据的准确性，依赖于空叶室校正的数据准确性。

那有没有一项技术，可以突破RACiR^TM的这种局限呢？比如说CO₂ Ramp rate能不能更快一些? 除了A-Ci曲线的测量，可不可以应用到其他类型的测量上呢？

下面我就用一些Slides，来讲一讲由LI-COR研发并成功应用到LI-6800的这项新技术。

其实对于开放式测量系统，它的Fundamental质量平衡公式是这个，相比之前的Slide，这个公式里多了一项，就是这个dc/dt。这个公式很好理解，这个_u1c1，代表了有多少CO₂进入了叶室，_u2c2是多少CO₂离开了叶室，SA这一项是多少CO₂被吸收，这个dc/dt就是叶室内的CO₂浓度随时间的变化。

在Steady State的情况下，dc/dt为零。就是说叶室内的CO₂浓度随时间是不变的。当dc/dt=0时，通过推导，你能看到这个A值，就是在Steady State下使用的公式。

所以，Steady State下使用的公式是Fundamental质量平衡方程的一种特殊状态，即dc/dt=0。

那么不在Steady State的情况下，或者说dc/dt不等于0的情况下，这个等式就是一个Dynamic质量平衡方程。在这种情况下，你把A值推导出来，就是右边这个公式。这个公式可以说是Dynamic Assimilation^TM Technique（动态吸收测量技术）的核心公式。

因为LI-6800的*性，比如说，快速精准连续的环境条件控制、叶室紧靠分析仪，以及Range Match功能，使得Dynamic Assimilation^TM Technique（动态吸收测量技术）这项新技术可以整合进LI-6800系统。

经验证，这项新技术优于传统的Steady State的测量方法以及RACiR^TM。

我们做空叶室实验，就是用关闭的空叶室，CO₂的同化速率A应该为零。当CO₂浓度改变后，比如CO₂浓度从400ppm提升到600ppm，基于Steady State的技术测量的数据点是右图中红色的Curve，能看到，CO₂同化速率A会有一个大的波动，等待一段时间（约40s）后，才会重新回到零。

基于这项新技术，CO₂同化速率A，也就是这个蓝色的Curve，只有一个小小的波动，并且很快（约5s）就回到了零。这意味着，在测量叶片的时候，等待的时间会大幅减少。

这张Slide，同样是空叶室实验，没有叶片，CO₂浓度从0ppm改变到1600ppm，连续变化的整个过程中，大家看到，这个蓝色的Curve，是使用新技术Dynamic Assimilation^TM Technique（动态吸收测量技术）测量得到的净光合速率A，整个过程一直保持在0附近。但是传统的测量方法，A值会有很长一段时间（约500s）的升高，当CO₂稳定以后，传统测量方法得到的A值才会重新回到0。

除了在空叶室的验证，以下这些Slides通过真实的测量叶片来验证这项新技术的优势。

下面左边这张图比对了三种不同的方法，做的A-Ci响应曲线，其中，蓝色、红色代表是Dynamic Assimilation^TM Technique（动态吸收测量技术），黄色代表的是RACiR^TM，紫色的方块和红色的×是传统方法所测量的A-Ci响应曲线。大家能看到这些结果是基本吻合的，DAT #1和#2有什么区别呢？CO₂ Ramp速率是不一样的，#1是200ppm/min, #2是400ppm/min。实验样品是向日葵叶片。大家可以看到，对于向日葵叶片来说，两个Ramp速率，结果差别很小。

你用400ppm/min来Ramp，就意味着做整条A-Ci曲线（10ppm-1600ppm），只需要4min，这就大大缩短了测量时间。传统测量方法，一条A-Ci响应曲线需要~30min。右边这张图就是Curve起始阶段放大后的图，大家可以看到，新技术和传统方法得到Vcmax、Jmax和二氧化碳补偿点是基本吻合的。但是，传统方法测量得到的数据点少，曲线出来的参数具有更高的不确定性。那除了A-Ci曲线，这项新技术也在调查类测量方面做了验证，并且有明显的优势。

下面这个实验是调查式测量，一开始这个叶室为关闭状态，空叶室CO₂R和CO₂S都是稳定的，起始阶段CO₂同化速率A也是稳定的。然后在这个时间点，叶室被打开，打开以后夹上叶片，关闭叶室，叶片之前做过光适应，蓝线是用新技术测量得到的CO₂同化速率，红色是传统方法测量得到的CO₂同化速率，可以明显的看到，这个新技术回到稳定状态更快。最右边这张图就是画圈部分的放大图，传统方法滞后约20-30s。

另外，这项新技术也能用于光响应曲线（A-Q Curve）的测量。由于植物响应光强变化要慢于CO₂的变化，使用这项新技术做光响应曲线测量时，光强的Ramp rate不能太快，因此完成光响应曲线所需要的时间与传统的常规方法是接近的。新技术的优点是数据点多，有助于更准确的曲线拟合。

总结一下，Dynamic Assimilation^TM（动态吸收测量技术）在三种重要的测量类型中，都可以应用，尤其是在A-Ci曲线测量和调查类测量中，新技术显著提高了测量速度，密集的数据点有助于曲线拟合；在光响应曲线（A-Q Curve）的测量中，优势体现在密集的数据采样上。

这项新技术是由LI-COR的两位科学家Aaron J Saathoff和Jon Welles共同开发，并成功整合应用到了LI-6800里面。关于这项新技术的文章，两个月前发表在Plant Cell& Environment杂志上，题目是Gas exchange measurements in the unsteady state（doi.org/10.1111/pce.14178）。这篇文章是Open Access的，大家感兴趣的可以找来读一下。好，今天我的报告就到这里，谢谢大家。

注：快来升级您手中的LI-6800高级光合-荧光测量系统（升级至1.5.02），体验这项创新功能吧！具体升级方法和测量前注意事项，请直接在网站后台留言，我们技术工程师会和您联系~